浓缩胶和分离胶

浓缩胶和分离胶的PH值不同,前者主要表现为浓缩效用,后者表现为电荷效用和分子筛效用。浓缩效应主要在浓缩胶中完成,浓缩胶的pH6.8,在这个pH条件下,缓冲液中的HCl的Cl离子几乎全部解离,Gly的等电点为6.0,仅少数解离为负离子,在电场中移动速度很慢。酸性蛋白质在此pH下解离为负离子,三类离子的迁移速率为Cl>一般蛋白质>Gly,电泳开始后,Cl离子泳动快,在其后留下一个低离子浓度区。Gly在电场中移动很慢,造成移动离子的缺乏,于是快慢离子间就形成了一个缺少离子的高压区,在高压区内所有的负离子都会加速移动,当移到Cl离子区域时,高电压消失,蛋白质的移动速度慢下来,当以上稳定状态建立后,蛋白质样品在快慢离子间被浓缩形成一个狭小的之间层,并按蛋白质所带负电荷量的多少依次排列成带,浓缩样品,从浓缩胶进入分离胶后,胶的pH升高,Gly的离解度增大,泳动率上升,又因为它分子小,故超过所有的蛋白质分子,紧跟在Cl离子后,Cl离子迁移后,低离子浓度不再存在,形成了恒定的电场强度,因此,蛋白质样品在分离胶中的分离主要取决于它的电荷性质,分子大小和形状,分离胶的孔径有一定大小,对不同相对质量的蛋白质来说,通过时收到的滞阻作用不同,即使静电荷相等的颗粒,也会由于这种分子筛的效应,把不同大小的蛋白质相互分开。
 
10%和12%胶的差别:
根据你目的蛋白分子量而定,如果说是分子量较大的蛋白(60KD以上),可以用10%的胶,分子量在60~30KD之间的可以用12%的胶,低于30KD的我一般都是用15%的胶了。主要在于指示线刚好跑出胶底的时候,你的目的蛋白能够恰好处于胶的中间部分。
凝胶的浓度大小不同所对应的凝胶孔径大小也不同,浓度小的孔径大,浓度大的孔径小,一般分离胶用12%的,浓缩胶用5%的,因为浓缩胶的目的就是将所有的蛋白浓缩在同一起跑线上,然后一块进入分离胶分离。 据蛋白大小定。

在电流的作用下,使蛋白质从胶转移**固相载体(膜)上。

膜的选择:印迹中常用的固相材料有NC膜、DBM、DDT、尼龙膜、PVDF等。我们选用PVDF(聚偏二氟乙烯),其具有更好的蛋白吸附、物理强度,以及具有更好的化学兼容性。 有两种规格:Immobilon-P(0.45um)和Immobilon-PSQ(0.2um for MW<20kDa)。
A 半干法
即将凝胶夹层组合放在吸有转印缓冲液的滤纸之间,通过滤纸上吸附的缓冲液传导电流,起到转移的效果。因为电流直接作用在膜胶上,所以其转移条件比较严酷,但是其转移时间短,效率高。
1 实验条件的选择
电流1mA-2mA/cm2,我们通常100mA/膜,按照目的蛋白分子大小、胶浓度选择转移时间具体可以根据实际适当调整。
目的蛋白分子大小(kDa) 胶浓度 转移时间
80---140  8%  1.5-2.0
25---80  10%  1.5
15—40  12%  0.75
<20     15%  0.5
2 实验操作
(1)滤纸和膜的准备 (在电泳结束前20分钟应开始准备工作)。
A. 检查是否有足够的transfer buffer,没有立即配制。
B. 检查是否有合适大小的滤纸和膜。
C. 将膜泡入甲醇中,约1-2分钟。再转入transfer buffer中。
D. 将合适的靠胶滤纸和靠膜滤纸分别泡入transfer buffer 中。
PDVF膜在进转移缓冲液时,要在甲醇里面泡多长时间?
PVDF是疏水性的,在转膜缓冲液里很难浸透,甲醇处理后使更容易浸润。 PVDF的预处理是用甲醇浸泡活化,浸泡透之后转入蒸馏水洗两次。用甲醇泡的目的是为了活化PVDF膜上面的正电基团,使它更容易跟带负电的蛋白质结合。
一般5-20分钟都有人在用。可在取胶的同时泡,估计前后5分钟左右。效果还不错。以前有站友发贴,说处理时间没多大关系,关键看膜的质量.确实是这样的。只要让膜完全浸透应该就没问题了。
Hybond的PVDF说明书这样的写的:“pre-wet the membrane in 100% methanol (10 seconds)”。 我的理解是,**少10秒钟,多泡下也没关系的,事实上,泡10秒的做过,10分钟的也做过,都没有问题的。
(2)转移
A. 在电转移仪上铺好下层滤纸。一般用三层。
B. 将膜铺在靠膜滤纸上,注意和滤纸间不要有气泡,再倒一些transfer buffer到膜上,保持膜的湿润。
C. 将胶剥出,去掉stack gel,小心的移到膜上。
D. 剪去膜的左上角,在膜上用铅笔标记出胶的位置。
E. 将一张靠胶滤纸覆盖在胶上。 倒上些transfer buffer,再铺两张靠胶滤纸。
F. 装好电转移仪,根据需要选定所需的电流和时间。
G. 转移过程中要随时观察电压的变化,如有异常应及时调整。
3 注意事项及常遇到的问题:
1)滤纸、胶、膜之间的大小,一般是滤纸>=膜>=胶。
2)滤纸、胶、膜之间千万不能有气泡,气泡会造成短路。
3)因为膜的疏水性,膜必须首先在甲醇中完全浸湿。而且在以后的操作中,膜也必须随时保持湿润(干膜法除外)。
4)滤纸可以重复利用,上层滤纸(靠膜)内吸附有很多转移透过的蛋白质,所以上下滤纸一定不能弄混,在不能分辨的情况下,可以将靠胶滤纸换新的。
5)转移时间一般为1.5 小时,( 1mA-2mA/cm2,10% gel),可根据分子量大小调整转移时间和电流大小。