上海亚荣旋转蒸发仪在海带硫酸化多糖的提取及纯化中的应用

海带硫酸化多糖的提取及纯化
1材料与方法
1.I实验材料与仪器
(1)材料.原料为荣成市人工养殖厂的干海带,D101大孔吸附树脂(国药集团化学试剂有限公司)D72型犬孔强酸性苯乙烯系鼷离子交换树脂、D315弱碱缝苯乙烯系阴褰子交换辫脂、D296大孔强碱性苯乙烯系阴离子交换树脂(南开大学化工厂),纤维索酶(150 000 U/g)、果胶酶(20 000 U/g)(上海蓝季科技发展有限公司),考马斯亮蓝G-250(Fluka进口分装),其它试剂均为国产分析纯.(2)仪器与设备.高速组织捣撵撰l(DS-1蘩,上海标本模型厂),电熬逐瀑瘩洛锶(◇K一98一l黧,金坛枣歪基仪器骞限公霭),离心撬
(TDL一5一A型,上海安亭科学仪器厂),旋转蒸发器(RE52~99型,上海亚荣生化仪器厂),循环水式多用真空泵(SHB-Ill型,郑州长城仪器厂),真空冷冻干燥机(Flexi—dry systems,Stone Ridge。NewYork。made inUSA),布氏灞斗,35 minx400 mm层斩柱,紫羚分光巍度计(3 300 RKD羹,索氏提取器).
1.2 LPS的粗提取
(1)酶提法提取LPS.准确称取海带,加入15倍的水,用高速组织捣碎机捣碎,依次加入纤维素酶0。25 g,果胶酶0。5 g,瀵匀,将pH篮漏**4.0,予40℃"-50℃水浴4 h,再升涅**80℃30 mim,使酶灭活,待冷却后收集滤液,将滤渣水洗两次合并滤液.所得滤液调pH值**7.0,经减压蒸馏浓缩**原体积的l/4~1/5,5 000 r/min离心15 min去除不溶性杂质.上清液加无水乙醇**总体积的30%,静置沉淀4 h,离心去除不溶物.上清液加无水乙醇**总体积的60%,低温过夜沉淀多糖后离心,沉淀依次用无水乙醇、乙醚、丙酮洗数次,冷冻干燥得LPS粗品.(2)水提法提取LPS.准确称取海带,加入20倍的水,用高速组织捣碎机捣碎.然后在70℃水浴中抽提4 h,其它步骤与酶解工艺相同.
1.3 LPS的初步纯化
(1)CTAB沉淀硫酸化多糖.将酶解法所提LPS粗品用适量蒸馏水溶解,加入2%的CaCl:静置2 h,5 000 r/rain离心15 min去除粗糖液中残留的褐藻胶,上清液加5%十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)沉淀酸性硫酸多糖.沉淀用3%的KCl溶解后,用三倍体积的乙醇沉淀,5 000 r/min离心15 min,沉淀依次用无水乙醇、乙醚、丙酮洗数次,冷冻干燥.(2)大孔吸附树脂脱色.取100 ml浓度为1%的粗多糖液加入1g处理过的树脂,放人恒温摇床,丁=30℃、120 r/rain、10 h,脱色后多糖液经双层滤纸过滤后,测定色素吸光值及糖含量,计算实验前后的溶液的脱色率及多糖回收率Is3,并对所选树脂脱色效果的因素进行研究
1.4 LPS成分的测定
(1)多糖含量的测定.总糖含量测定采用蒽酮硫酸法[6],还原糖含量测定采用3,5一二硝基水杨酸(DNS)比色法[7],均用葡萄糖作为对照品做标准曲线.
(2)蛋白质含量的测定.采用考马斯亮兰比色法[8],以牛血清白蛋白做标准品绘制标准曲线.
(3)硫酸根含量测定.采用比浊法[9],以硫酸钠做标准品绘制标准曲线.

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