SDS-PAGE电泳的基本原理及浓缩胶浓缩样品的原理

SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)是目前**常用的分离蛋白质的电泳技术
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS, SDS能断裂分子内和分子间氢键,破坏蛋白质的二级和三级结构,强还原剂能使半胱氨酸之间的二硫键断裂,蛋白质在一定浓度的含有强还原剂的SDS溶液中,与SDS分子按比例结合,形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物,这种复合物由于结合大量的SDS,使蛋白质丧失了原有的电荷状态形成仅保持原有分子大小为特征的负离子团块,从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异,由于SDS与蛋白质的结合是按重量成比例的,因此在进行电泳时,蛋白质分子的迁移速度取决于分子大小。当分子量在15KD到200KD之间时,蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系,符合下式:logMW=K-bX,式中:MW为分子量,X为迁移率,k、b均为常数,若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图,可获得一条标准曲线,未知蛋白质在相同条件下进行电泳,根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。

SDS-PAGE电泳成功的关键是什么?

①溶液中SDS单体的浓度  SDS在水溶液中是以单体和SDS-多肽胶束的混合形式存在,能与蛋白质分子结合的是单体。为了保证蛋白质与SDS的充分结合,它们的重量比应该为1∶4或1∶3。 ②样品缓冲液的离子强度  因为SDS结合到蛋白质上的量仅仅取决于平衡时SDS单体的浓度,不是总浓度,而只有在低离子强度的溶液中,SDS单体才具有较高的平衡浓度。所以,SDS电泳的样品缓冲液离子强度较低,常为10-100 mM。 ③二硫键是否完全被还原  只有二硫键被完全还原以后,蛋白质分子才能被解聚,SDS才能定量地结合到亚基上从而给出相对迁移率和分子质量对数的线性关系。Sample buffer中的β-巯基乙醇的浓度常为4-5%,二硫苏糖醇的浓度常为2-3%。前者有挥发性,**好使用前加入。

SDS-PAGE缓冲液系统的选择,Tris-Glycine、Tris-Tricine、Tris-硼酸盐或者其他?

一般来说,在被分析的蛋白质稳定的pH范围,凡是不与SDS发生相互作用的缓冲液都可以使用,但缓冲液的选择对蛋白带的分离和电泳的速度是非常关键的。Tris-甘氨酸系统是目前使用**多的缓冲系统。Tris-甘氨酸系统是目前使用**多的缓冲系统。如果要测定糖蛋白的分子量,**好采用Tris-硼酸盐缓冲系统,对于分子质量小于15 kDa的蛋白样品,可以使用SDS-尿素系统,也可以采用Tris-tricine缓冲系统。

积层胶(或称浓缩胶)的作用原理?

在缓冲系统中的弱酸,如甘氨酸,在pH6.7时很少解离,其有效泳动速率很低,而氯离子却有很高的泳动速率,蛋白质的泳动速率介于两者之间。加上电压以后,作为先导离子的氯离子和尾随离子的甘氨酸离子分离开来,并在其后面留下一个导电性较低的区带。由于导电性和电场强度成反比,这一区带便获得较高的电压梯度,加速甘氨酸离子的泳动,使其赶上氯离子,建立起甘氨酸和氯离子的电压梯度和泳动速率乘积相等的稳定态(我不太明白这句话),使这些带电颗粒以相同的速度泳动,两种离子之间有明显的边界。当甘氨酸、氯离子界面通过样品进入浓缩胶时,在移动界面前有一低电压梯度,界面后有一高电压梯度。由于在移动界面前的蛋白质分子泳动速率比氯离子低,因此氯离子能迅速越过。移动界面后的蛋白质处于较高的电压梯度中,其泳动速率比甘氨酸快。因此,移动的界面将蛋白质分子堆积到一起,形成一条狭窄的区带。蛋白质在移动界面中的浓度作用仅取决于样品和浓缩胶中Tris-HCl的浓度(为什么?),而与样品中蛋白质的**初浓度无关。由于浓缩胶为大孔凝胶,故对蛋白样品没有分子筛作用。当移动的界面到达浓缩胶和分离胶的界面时,凝胶的pH明显增加,导致甘氨酸大量解离。此时,甘氨酸的有效泳动速率明显增加,超越蛋白分子,直接在氯离子后移动。由于凝胶孔径变小,蛋白质分子的迁移速率降低,落在后面的蛋白质便在均一的电压梯度和pH环境中泳动,并根据其固有的电荷与分子大小进行分离。

SDS-page电泳小问答
Q:SDS-PAGE电泳的基本原理?
A:SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS(十二烷基硫酸钠), SDS能断裂分子内和分子间氢键,破坏蛋白质的二级和三级结构,强还原剂能使半胱氨酸之间的二硫键断裂,蛋白质在一定浓度的含有强还原剂的SDS溶液中,与SDS分子按比例结合,形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物,这种复合物由于结合大量的SDS,使蛋白质丧失了原有的电荷状态形成仅保持原有分子大小为特征的负离子团块,从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异,由于SDS与蛋白质的结合是按重量成比例的,因此在进行电泳时,蛋白质分子的迁移速度取决于分子大小。当分子量在15KD到200KD之间时,蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系,符合下式:logMW=K-bX,式中:MW为分子量,X为迁移率,k、b均为常数,若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图,可获得一条标准曲线,未知蛋白质在相同条件下进行电泳,根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。
  
Q:配胶缓冲液系统对电泳的影响?
A:在SDS-PAGE不连续电泳中,制胶缓冲液使用的是Tris-HCL缓冲系统,浓缩胶是pH6.7,分离胶pH8.9;而电泳缓冲液使用的Tris-甘氨酸缓冲系统。在浓缩胶中,其pH环境呈弱酸性,因此甘氨酸解离很少,其在电场的作用下,泳动效率低;而CL离子却很高,两者之间形成导电性较低的区带,蛋白分子就介于二者之间泳动。由于导电性与电场强度成反比,这一区带便形成了较高的电压剃度,压着蛋白质分子聚集到一起,浓缩为一狭窄的区带。当样品进入分离胶后,由于胶中pH的增加,呈碱性,甘氨酸大量解离,泳动速率增加,直接紧随氯离子之后,同时由于分离胶孔径的缩小,在电场的作用下,蛋白分子根据其固有的带电性和分子大小进行分离。