蛋白质浓缩问题——超滤浓缩管的使用及保存

二、离心超滤管浓缩样品
2.1  浓缩样品
1、要浓缩的样品含盐量必须0.3M以上,含盐量低的样品须补加到0.3MNaCl。
2、在内管(附有3KD膜)中加入500µl样品,将内管套入外管。
3、对称放置离心管,14520rpm(即14000g)离心。(离心5min约浓缩2倍,10min约4倍,15min约6倍,20min约8倍,30min约10倍)。
4、离心结束后,将内管倒置套在另一个干净的离心管呢,3880rpm离心min收集浓缩后的样品。或者用移液器直接吸出内管中的样品。
2.2  浓缩管使用后的处理和保存
1、使用完的浓缩管,立即加入500µl含1MNaCl的缓冲液(此缓冲液与浓缩样品的缓冲液一致),8000rpm离心20min。
2、甩净内管中的盐溶液,将内管放入超纯水中浸泡1h。
3、内管加入超纯水500µl,8000rpm离心5min。
4、甩净内管中的水,加入500µl0.2MNaOH,8000rpm离心20min。
5、甩净内管中的NaOH溶液,用超纯水再8000rpm离心5min。
6、甩净内管中的水,放入含0.2-0.5‰NaN3的生理盐水中。
7、外管用自来水洗净后,用超纯水冲洗干净,晾干。
 
 
超滤管使用注意事项  

蛋白浓缩和换Buffer通常使用的超滤管,常用Millipore的Amicon-Ultra-15超滤管(MWCO10kD)。也有其它型号 的、不同体积大小和MWCO超滤管可选,视目的蛋白的分子量与浓缩前体积、浓缩目标体积而定。可重复使用,使用一次就扔掉太浪费。以下是个人总结的使用方 法和注意事项。
  1、选择合适的超滤管,主要考虑MWCO和浓缩体积,**常见的是Ultra-15(10kD)。到底选择多大截留分子量比较合适呢?10kDa、 5kDa、还是30kDa?通常应截留分子量不应大于目的蛋白分子量的1/3,比如目的蛋白分子量为35kDa,就可以选择10kDa截留分子量的超滤管。若目的蛋白分子量为10kD左右,则可以用截留分子量3kD的超滤管。认真阅读使用说明书,注意超滤膜对各种化学物质的耐受程度有所不同,表格中有。
  2、新买来的超滤是干燥的,使用前加入MilliQ水,水量完全过膜,冰浴或冰箱里预冷几分钟。然后将水倒出,即可加入蛋白液,加入的多少,以不超过管顶的白线为准。操作要轻,加入蛋白液前,超滤管需要插在冰上预冷。
  3、平衡。质量和重心二者都要达到平衡。注意转速和加速度不可太快,否则直接损坏超滤膜。开始离心超滤(离心机预冷**4度)。不同离心机的转速 rpm换算成g之后,有所不同。具体可参阅附件里的说明书。离心机的加速度调****低档,减小对膜的压力。注意,一定要等离心机达到目的转速之后,方可离开 离心机,否则离心机出问题时,无法**时间处理,后果不可预测!膜与转轴的方向根据说明书调整(角转离心机的情况是膜与轴垂直)。在实际使用中,一般转速 开的比说明书里的要低,这样可以延长离心管的使用寿命。
  4、当浓缩到剩下1ml时,取50ul国产Bradford溶液,加入10ul流穿,看有没变蓝色,以此判断超滤管是否漏掉蛋白。如果管漏了,将上层和流穿重新倒入新管中开始超滤。要精确判断是否漏管,用5mgml的BSA离心10min,再取流穿,跑蛋白胶或Bradford粗测,继续加入剩下的蛋白液浓缩(在冰上操作,防止蛋白受热),直到所有浓缩液都加完为止。离心过程中注意是否发生蛋白沉淀,导致堵管。若发生沉淀,要确定沉淀的具体原因,是蛋白浓度过高还是Buffer不合适;前者可用多根超滤管同时超滤,降低浓度的办法解决,后者的方法是换不同的Buffer,直到蛋白不发生沉淀为 止。
  5、前面几步用以浓缩蛋白,如果要换Buffer,在总蛋白液浓缩**1ml左右的时候,轻轻加入新的Buffer(经0.22um超滤膜超滤),再 浓缩**1ml左右,连续三次,**后一次的浓缩终体积根据需要的蛋白浓度而定,一般不多于500ul,也有浓缩**200ul以内的情况。按照每次**少10倍 左右的体积浓缩算,三次达到1000倍以上,基本上可以达到换buffer的目的。